HRP/ALP标记SA在诊断试剂中的应用及评价

酶标抗体和蛋白是现代免疫诊断试剂的核心信号放大元件。其中，辣根过氧化物酶（HRP）和碱性磷酸酶（ALP）标记的链霉亲和素（SA）等试剂，因其高灵敏度、强特异性，在疾病诊断、食品安全、科研等领域应用广泛。本文将从应用场景、标记工艺及性能评价，对HRP标记链霉亲和素及ALP标记链霉亲和素进行梳理。

应用场景：链霉亲和素对生物素具有极高的亲和力（Kd≈10^-15M）。HRP标记后，它成为生物素-亲和素放大系统的核心组件。该产品广泛应用于免疫层析试纸条、ELISA及免疫印迹实验，尤其适用于兽药残留、食品安全高通量检测试剂的开发。通过与生物素标记的一抗或二抗结合，可极大增强检测信号。

标记工艺：采用高纯度链霉亲和素与HRP共价偶联的工艺制备。为确保产品性能稳定、批间差异小，生产过程中需精确控制偶联比例和纯化步骤，以获得高比活性、低非特异性吸附的偶联物。

图1 HRP标记抗体原理图

应用场景：碱性磷酸酶（ALP）是另一类重要的报告酶。ALP标记的链霉亲和素（SA-ALP）同样用于生物素检测系统，适用于Western印迹、ELISA、免疫组织化学等多种标准测定方法。与HRP系统相比，ALP系统在碱性条件下工作，其底物（如BCIP/NBT）产生的颜色沉淀更稳定，适用于需要长期保存的膜检测或切片。

标记工艺：通过化学交联将ALP与链霉亲和素连接。目前常用的碱性磷酸酶偶联方法有过碘酸钠氧化法、碳二亚胺法和SMCC异性双功能偶联法（如图2及3所示）等。过碘酸钠氧化法是先将酶进行醛基化，然后和抗体偶联，这种操作比较复杂，偶联产物有效活性浓度低。碳二亚胺法利用碳二亚胺类物质对蛋白质进行羧基化，这种方法容易形成蛋白分子间的自身聚合，产生非均一性产物。SMCC异性双功能偶联法利用SMCC的异性官能团，分别连接碱性磷酸酶和抗体，这种方法相比过碘酸钠法和碳二亚胺法偶联效率高。

1）将纯化好的鼠IgG按照一定浓度包被96孔板备用。

2）将纯化后的羊抗兔标记的生物素结合物并进行纯化，配制成一定浓度试剂备用。

3）将西宝生物与进口JACKSON的HRP标记SA采用合适的稀释液配制为相同的工作浓度。

4）将兔抗鼠-IgG使用1xPBS按照如下浓度50ng/mL、25ng/mL、12.5ng/mL、6.25ng/mL、3.125ng/mL、1.56ng/mL、0.78ng/mL、0ng/mL配制完成。

5）配制好的梯度样品按照每孔50ul加入包被的发光板中，再加入羊抗兔-生物素试剂与酶结合物按照每孔各50ul加入包被的发光板中，37℃反应20min后洗板。

6）将反应好的板去除上清液，并用清洗液进行洗涤，每块板洗涤三次。

7）在洗涤完成的板中加入100ul发光底物，37℃孵育5min，加入100ul终止液，在酶标仪上测OD值，并导出、处理、汇总数据。

1）采用西宝SA-HRP批次1与进口JACKSON SA-HRP做性能对比，结果平均偏差2.8%，说明西宝SA-HRP与进口JACKSON SA-HRP性能相当，可进行国产替代；

2）采用西宝SA-HRP批次2与西宝SA-HRP批次1做性能对比，结果平均偏差3.4%，说明西宝SA-HRP批间差异小。

分析：将西宝HRP-SA批次1及批次2浓缩液分别做37℃热加速实验，结果热加速7天平均变化分别为1.3%、-4.0%，表明西宝HRP-SA浓缩液热稳定性良好。

1）将磁珠包被的肌酸激酶同工酶（CK-MB）抗体（抗体货号：EKY0095J）用合适的稀释液稀释成工作液1。

2）将生物素标记肌酸激酶同工酶（CK-MB）抗体（抗体货号：EKY0095K）用合适的稀释液稀释成工作液2。

3）将SA-ALP用用合适的稀释液稀释成工作液3。

4）上全自动化学发光仪器进行测试CK-MB抗原（抗原货号：EDD0408B）梯度，记录发光值。

1)采用西宝SA-ALP批次1与参比厂家（国产某品牌B）SA-ALP做性能对比，结果平均偏差13.3%，说明西宝SA-ALP与参比厂家（国产某品牌B） SA-ALP性能相当，可进行替代；

2)采用西宝SA-ALP批次2与西宝SA-ALP批次1做性能对比，结果平均偏差2.0%，说明西宝SA-ALP批间差异小。

分析：将西宝SA-ALP批次1及批次2浓缩液分别做37℃热加速实验，结果热加速7天平均变化分别为1.9%、-2.5%，表明西宝SA-ALP浓缩液热稳定性良好。