辣根过氧化物酶标记二抗在免疫诊断试剂中的应用优势与评估

酶标抗体和蛋白是现代免疫诊断试剂的核心信号放大元件。其中，辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗鼠、羊抗兔，因其高灵敏度、强特异性，在疾病诊断、食品安全、科研等领域应用广泛。本文将从应用场景、标记工艺及性能评价，对HRP标记羊抗鼠、HRP标记羊抗兔进行梳理。

应用场景：该产品是检测小鼠来源一抗（如单克隆抗体）的通用二抗。其主要应用于酶联免疫吸附试验（ELISA）、蛋白质印迹（Western Blot）以及免疫组化（IHC）等平台，特别在食品安全检测（如兽药残留分析）和基础科研中扮演关键角色。它能特异性识别小鼠IgG的重链和轻链，且与人类IgG无交叉反应，保证了检测的特异性。

标记工艺：主流工艺是过碘酸钠氧化法（如图1所示）。这种方法的基本原理是将HRP的糖基用过碘酸钠氧化成醛基，然后这个醛基与抗体的氨基（-NH2）反应，形成希夫氏碱（Schiff base）。为了防止HRP中糖的醛基与其自身蛋白的氨基发生偶合，通常会在用过碘酸钠氧化前先用二硝基氟苯阻断氨基。氧化反应结束后，再用氰基硼氢化钠或硼氢化钠来稳定希夫氏碱。

 

图1 HRP标记抗体原理图

应用场景：作为检测兔源一抗的二抗，广泛应用于Western Blot、ELISA和免疫组化检测。在临床诊断试剂盒（如自身抗体检测、传染病检测）及病理学研究中被大量使用。其高灵敏度、低背景的特性，使得对微弱信号的检测成为可能。

标记工艺：其标记原理与HRP标记羊抗鼠相同，主要采用过碘酸钠法。通过对高纯度山羊抗兔IgG进行亲和纯化，再与HRP进行共价偶联，确保产物具有高特异性和稳定的酶活性。

1）将纯化好的人IgG按照一定浓度包被96孔板备用。

2）将西宝生物与进口品牌Jackson的HRP标记羊抗鼠IgG二抗采用合适稀释液稀释成相同的工作浓度。

3）将鼠-IgG使用1xPBS按照如下浓度50ng/mL、25ng/mL、12.5ng/mL、6.25ng/mL、3.125ng/mL、1.56ng/mL、0.78ng/mL、0ng/mL配制完成。

4）配制好的梯度样品按照每孔50ul加入包被板中，再加入酶工作液按照每孔50ul加入包被的发光板中，37℃反应20min后洗板。

5）将反应好的板去除上清液，并用清洗液进行洗涤，每块板洗涤三次。

6）在洗涤完成的板中加入100ul发光底物，37℃孵育5min，加入100ul终止液，在酶标仪上测OD值，并导出、处理、汇总数据。

1）采用西宝HRP-羊抗鼠IgG批次1与进口品牌Jackson HRP-羊抗鼠IgG做性能对比，结果平均偏差6%，说明西宝HRP-羊抗鼠IgG与进口品牌Jackson HRP-羊抗鼠IgG性能相当，可进行国产替代；

2）采用西宝HRP-羊抗鼠IgG批次2与西宝HRP-羊抗鼠IgG批次1做性能对比，结果平均偏差0.4%，说明西宝HRP-羊抗鼠IgG批间差异小。

1）浓缩液37℃热加速试验

分析：将西宝HRP-羊抗鼠IgG批次1浓缩液分别做37℃热加速实验，结果表明热加速7天、10天、15天平均变化分别为2.1%、-2.8%及4.1%，表明西宝HRP-羊抗鼠IgG浓缩液热稳定性良好。

2）工作液37℃热加速试验

1）将西宝HRP-羊抗鼠IgG批次1采用Seebio® HRP标记抗体稀释液1（货号：DCC0268B）稀释成工作液分别做37℃热加速实验，结果表明热加速7天、15天平均变化分别为-3.1%及-1.0%，表明在Seebio® HRP标记抗体稀释液1（货号：DCC0268B）下西宝HRP-羊抗鼠IgG配制成工作液热稳定性良好；

2）将西宝HRP-羊抗鼠IgG批次1采用Seebio® HRP标记抗体稀释液2（货号：DCC0268C）稀释成工作液分别做37℃热加速实验，结果表明热加速7天、15天平均变化分别为-4.1%及-1.4%，表明在Seebio® HRP标记抗体稀释液2（货号：DCC0268C）下西宝HRP-羊抗鼠IgG配制成工作液热稳定性良好。

1）将纯化好的鼠IgG按照一定浓度包被96孔板备用。

2）将西宝生物与进口Jackson的HRP标记羊抗兔IgG采用合适稀释液稀释成相同的工作浓度。

3）将兔抗鼠-IgG使用1xPBS按照如下浓度50ng/mL、25ng/mL、12.5ng/mL、6.25ng/mL、3.125ng/mL、1.56ng/mL、0.78ng/mL、0ng/mL配制完成。

4）配制好的梯度样品按照每孔50ul加入包被的发光板中，再酶工作液按照每孔50ul加入包被的发光板中，37℃反应20min后洗板。

5）将反应好的板去除上清液，并用清洗液进行洗涤，每块板洗涤三次。

6）在洗涤完成的板中加入100ul发光底物，37℃孵育5min，加入100ul终止液，在酶标仪上测OD值，并导出、处理、汇总数据。

1）采用西宝HRP-羊抗兔IgG批次1与进口品牌Jackson的 HRP-羊抗兔IgG做性能对比，结果平均偏差为3.5%，说明西宝HRP-羊抗兔IgG与进口品牌Jackson的HRP-羊抗兔IgG性能相当，可进行国产替代；

2）采用西宝HRP-羊抗兔IgG批次2与西宝HRP-羊抗兔IgG批次1做性能对比，结果平均偏低0.7%，说明西宝HRP-羊抗兔IgG批间差异小。

1）浓缩液37℃热加速试验

分析：将西宝HRP-羊抗兔IgG批次1浓缩液分别做37℃热加速实验，结果表明热加速7天、10天、15天平均变化分别为5.9%、-2.2%及-3.7%，表明西宝HRP-羊抗兔IgG浓缩液热稳定性良好。

2）工作液37℃热加速试验

1）将西宝HRP-羊抗兔IgG批次1采用Seebio® HRP标记抗体稀释液1（货号：DCC0268B）稀释成工作液分别做37℃热加速实验，结果表明热加速7天、15天平均变化分别为-4.7%及-3.3%，表明在Seebio® HRP标记抗体稀释液1（货号：DCC0268B）下西宝HRP-羊抗兔IgG配制成工作液热稳定性良好；

2）将西宝HRP-羊抗兔IgG批次1采用Seebio® HRP标记抗体稀释液2稀释成工作液分别做37℃热加速实验，结果表明热加速7天、15天平均变化分别为-1.7%及-5.1%，表明在Seebio® HRP标记抗体稀释液2下西宝HRP-羊抗兔IgG配制成工作液热稳定性良好。