你需要的大规模纯化外泌体方法来了
发布时间：2024-02-21 点击数：114
外泌体的概念，研究热度及应用领域在这里就不在赘述，感兴趣的可以参考上一篇，初识外泌体。本文着重介绍一种基于PS层析捕获法的大规模分离和纯化高纯度EV的技术。
众所周知，由于外泌体在大小，组成和功能方面存在异质性，其分离和纯化一直面临着挑战，加之外泌体的纯化分离文献方法众多，国际上也没有限定单一的分离手段，因此根据需求选择合适的外泌体分离纯化方案，对于外泌体研究至关重要！
本文介绍的新型PS层析方法支持规模放大的细胞培养上清中简易分离和纯化EV。
富士胶片和光采用与金泽大学医学系免疫学的华山教授共同开发的分离和纯化技术“PS亲和法”1），开发了用于大规模纯化EV的MassivEV™ EV Purification Column PS（MassivEV™ 细胞外囊泡（EV）纯化分离柱 PS）。配合使用专用的缓冲液MassivEV™ Purification Buffer Set（MassivEV™ 细胞外囊泡（EV）纯化缓冲液套装），可从支持规模放大的细胞培养上清中简易分离和纯化EV。
一 纯化原理
◆PS亲和法利用与EV膜表面的磷酯酰丝氨酸（PS）特异性结合Tim4（(T-cell immunoglobulin domain and mucin domain-containing protein 4)）的性质。在钙离子存在下，固定在载体上的Tim4可捕获样品中的EV。通过清洗去除杂质后，加入EV Elution Buffer（螯合剂），低损伤状态下从载体上的Tim4的洗脱和纯化EV的方法(富士胶片和光开发的EV分离方法)，该方法可使EV在完整状态下高纯度分离。
图1. MassivEV™ EV Purification Column PS（PS亲和法）分离和纯化细胞外囊泡的原理
二 产品概要
产品组成：MassivEV™ 细胞外囊泡（EV）纯化分离柱 PS
产品组成：MassivEV™ 细胞外囊泡（EV）纯化缓冲液套装
MassivEV™ 细胞外囊泡（EV）纯化分离柱 PS
MassivEV™ 细胞外囊泡（EV）纯化缓冲液套装
三 产品优势
l 使用方便，纯度高，形态完整，耗时短，无仪器需求
l 可从大规格（10 mL至1L级别规格）细胞培养上清中高效分离和纯化高纯度EV
l 只需一个蠕动泵 无需切向流过滤（TFF）系统等昂贵设备
l 高性价比（处理同一样品时，可重复使用分离柱5次）
四 操作流程
五 应用对比
表1 从200 mL间充质干细胞培养上清中分离和纯化EV的对比（富士胶片和光评估）
MassivEV™ | TFF+AEX* | TFF+SEC* | |
可纯化的EV | PS阳性EV | 取决于样品 | 取决于样品 |
纯度 | 高 | 低 | 低 |
纯化步骤数 | 1个步骤 - PS亲和法 | 2个步骤 -TFF系统 -阴离子交换色谱法 | 2个步骤 -TFF系统 尺寸排阻色谱法 |
EV粒子产量（参考值） | 1.7x1011 particles | 1.1x1011 particles | 0.7x1011 particles |
纯化所需时间 | 8 h | 10 h | 10 h |
* AEX：阴离子交换色谱法；*SEC：尺寸排阻色谱法
参考：一只小鼠的EV建议给药量[2-4]）：1.0×109particles/mouse
六 性能数据
6.1 处理样品量
1mL | 5mL | |
产品编号 | 131-19491 | 137-19493 |
样品量*1 | 200mL | 1L |
动态结合能力*2 | 5×1011 particles/mL 树脂 | 2.5×1012 particles/5 mL树脂 |
*1 MSC细胞培养上清中一次纯化可处理的大概样品量。样品处理量因细胞培养上清中所含的EV粒子数而异。处理同一样品时，可重复使用分离柱，已确认最多可使用五次（初次使用1次、重复使用4次）。
*2 使用MSC来源EV的研究结果。可能因细胞种类等条件而异。
6.2 与传统方法对比
在增殖培养基（MS Culture™/ 10% FBS)及EV生产培养基（EV-Up™）中培养骨髓来源的MSC，回收细胞培养上清后，使用0.22 μm过滤器过滤。取200 mL经过滤处理的细胞培养上清用作样品，采用以下4种方法进行分离和纯化。纯化后的EV溶液分别使用Nanoparticle Tracking Analysis (NTA)和ELISA进行分析。
分离方法
MassivEV™：MassivEV™ EV Purification Column PS / MassivEV™ Purification Buffer Set (本产品, PS亲和法)
TFF：仅切向流过滤（500 kDa）
TFF+AEX：切向流过滤（500 kDa）＋阴离子交换色谱法
TFF+SEC：切向流过滤（500 kDa）＋尺寸排阻色谱法
（1）使用NTA 进行粒子分析
【结果】与TFF相比，MassivEV™ 纯化得到的粒子数量少，但与 TFF+AEX 或 TFF+SEC 相比，MassivEV™ 纯化得到的粒子数量更多
（2）使用CD63 ELISA和CD81 ELISA的EV回收率比较（n=3）
【结果】
相比传统方法，使用MassivEV™的EV回收率更高。
参考文献
1. Nakai, W.et al.:Sci. Rep.6(1), 1(2016).
2. Mansouri, N.et al.:JCI insight,4(21), e128060(2019).
3. Angioni, R.et al.:Int. J. Mol. Sci.,21(22), 8874(2020).
4. Perets, N.et al.:Mol. Autism,11(1), 65(2020).
产品列表
适用于10 mL至1L级细胞培养上清
产品编号 | 产品名称 | 产品规格 | 产品应用 |
131-19491 | MassivEV™ EV Purification Column PS MassivEV™细胞外囊泡（EV）纯化分离柱PS | 1mL | 基因研究 |
137-19493 | 5mL | 基因研究 | |
295-96601 | MassivEV™Purification Buffer Set MassivEV™细胞外囊泡（EV）纯化缓冲液套装 | 1mL×10次用 (5mL×2次用) | 基因研究 |
以上MassivEV™ EV Purification Column PS、MassivEV™Purification Buffer Set请配合一同使用
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以上EV-Up™基础培养基、EV-Up™添加剂请配合一同使用
※ 仅供实验研究用，不可用于临床诊断。
答疑解惑
Q：MassivEV纯化分离柱缓冲液套装适合纯化哪些细胞外囊泡？
A：可提取脂质膜表面暴露出磷脂酰丝氨酸（PS）的外泌体和微囊泡。
A：可提取脂质膜表面暴露出磷脂酰丝氨酸（PS）的外泌体和微囊泡。
Q：是不是所有的外泌体都会暴露磷脂酰丝氨酸（PS）呢？
A：迄今为止所发现的外泌体，并非所有的外膜表面都暴露PS。例如，细菌来源的外泌体膜表面没有PS，因此，本款试剂不能提取这种外泌体。
现在的研究尚未得知是否所有的外泌体上都会露出PS，但是上述的外泌体标记根据细胞种类不同表现出的信号强弱差大，通过利用PS亲和法捕捉、提取外泌体是较好的方法。
A：迄今为止所发现的外泌体，并非所有的外膜表面都暴露PS。例如，细菌来源的外泌体膜表面没有PS，因此，本款试剂不能提取这种外泌体。
现在的研究尚未得知是否所有的外泌体上都会露出PS，但是上述的外泌体标记根据细胞种类不同表现出的信号强弱差大，通过利用PS亲和法捕捉、提取外泌体是较好的方法。
Q：我们实验室最近经费有限呢，MassivEV 纯化分离柱可以循环利用吗？
A：使用MSC来源EV的研究结果表明：处理同一样品时，可重复使用分离柱，已确认最多可使用五次（初次使用1次、重复使用4次）。
A：使用MSC来源EV的研究结果表明：处理同一样品时，可重复使用分离柱，已确认最多可使用五次（初次使用1次、重复使用4次）。
Q：用该试剂盒提取出来的囊泡怎么判断是外泌体呢？
A：可以用和表面抗原对应的抗体进行免疫印迹（WB）、透射电子显微镜（TEM）、纳米粒径分析（如NanoSight LM10）等来验证。ISEV建议用表面蛋白CD63等来界定所提取的细胞外囊泡，可使用Wako的PS Capture™ Exosome ELISA Kit (Streptavidin HRP)（产品编号298-80601，见上产品列表），既能鉴定外泌体的CD63信号，又能进行定量、定性分析，一举两得！
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