EVAGLAX(TM)细胞外囊泡分离纯化试剂盒使用说明

EVAGLAX?细胞外囊泡分离纯化试剂盒使用说明

EVAGLAX采用了孔径精确可控、并带有抗蛋白质非特异性吸附涂层的多孔玻璃作为过滤膜。无需使用超速离心机即可简便快速地提取来自细胞外囊泡的RNA和蛋白质。同时，离心柱类型易于操作，简化了实验流程，有望减少操作的个体差异，确保实验的重现性。

用途

用于早期诊断和治疗选择的细胞外囊泡衍生生物标志物提取
生物标志物研究、细胞外囊泡基础研究
可用于体液（血清、血浆、尿液等）和细胞培养上清等

特征

孔径精确可控的三维多孔玻璃技术
抗杂质蛋白质非特异性吸附的涂层技术
简便快速地分离细胞外囊泡（15 分钟）
基于尺寸排阻色谱法的原理，可以无偏差地捕获细胞外囊泡

关键技术

多孔玻璃的孔径精确可控，根据尺寸排阻色谱法的原理，可选择性的捕捉细胞外囊泡大小的粒子。
滤膜表面涂有抗杂质蛋白质非特异性吸附的涂层，可抑制白蛋白等杂质蛋白的吸附。
通过与清洗液配合使用，可提高滤膜中捕获的细胞外囊泡的纯度。

操作流程

1.预处理
用?0.22 μm 针筒式过滤器预处理样品。
2.细胞外囊泡捕获
将样品?(100-500uL) 注入离心柱中并离心?10 分钟。
3.洗涤
将清洗液注入离心柱中并离心?5 分钟。
4.提取
使用市售的提取试剂从离心柱中提取?RNA 和蛋白质进行分析。

产品组成

商品	20 次检测	100次检测
离心柱	20件	100件
收集管(1.5mL)	20件	100件
洗涤缓冲液A	10mL	50mL
洗涤缓冲液B	10mL	50mL

本试剂盒以外的、需要额外准备的耗材

类别	耗材种类	产品名	厂家	型号
通用	0.2μmPre-filter	Minisart Syringe Filter0.2μm	Sartorius	S6534FMOSK
通用	1mLSyringe	-	-	-
通用	1.5mL low protein adsorption tube	-	-	-
通用	2.0mL low protein adsorption tube	-	-	-
对于RNA	miRNeasy	miRNeasy Micro Kit	QIAGEN	217084
对于蛋白质	M-PER	Mammalian Protein Extraction Reagent	Thermo Fisher Scientific	78501

保存条件

将试剂盒存放在2-10°C的冷藏环境中。

使用目的

本产品仅供研究使用。请不要将本产品用于人类或动物的医学或临床诊断。

细胞外囊泡分离步骤

【样品制备过程】

如果标本已冷冻，请确保在4°C下解冻。
使用?0.2μm滤膜过滤样品

*如果标本粘度高或者含有大量碎屑，建议先进行粗离心10,000G/30 min，然后用?0.2μm滤膜过滤上清液。?粗离心时，建议取上清后留150μL。

【细胞外囊泡捕获过程】

将100-500μL样品添加到离心柱中。
以6,000G离心10分钟。（如果转速不足，追加10,000G/3分钟离心）

*如果担心样品堵塞，请将离心机的温度设置为25°C。

丢弃含有流出液的外管，将内管插入一个新的1.5mL低蛋白吸附的收集管。

（*如果样品中有杂质，可选择追加以下操作：

①样品中的杂质略高的情况

向离心柱中加入100μL洗涤缓冲液A，并以3,000G/5分钟离心。
丢弃含有流出液的外管，将内管插入一个新的2mL低蛋白吸附的收集管。

②样本中的杂质含量高的情况

将300μL洗涤缓冲液B放入离心柱并以3,000G/5分钟离心。
丢弃含有流出液的外管，将内管插入一个新的2mL低蛋白吸附的收集管。

细胞外囊泡裂解步骤

【蛋白质提取工艺】

向离心柱中加入100uL M-PER ，并以500G/1分钟离心。

*请勿丢弃流出液。使用2.0 mL低蛋白吸附的收集管，无需更换。

在室温下保持5分钟?。
以6,000G/5分钟离心。（或者10,000G/3分钟，视情况而定）
收集管中的液体即是样品。

【RNA提取过程】

向离心柱中加入500uLQIAzol并以500G/1分钟离心。

*请勿丢弃流出液。使用2.0mL低蛋白吸附的收集管，无需更换。

在室温下放置5分钟。
以6,000G/5分钟离心。（或者10,000G/3分钟，视情况而定）
将离心得到的液体转移到新的1.5mL低蛋白吸附管中。不需要离心柱。
加入140uL氯仿，涡旋搅拌15秒，室温放置3分钟。
在4°C下以12,000G离心15分钟，样品分成3层。顶部透明层是含有RNA的水层，请吸出280μL透明层，注意避免混入下面的白色和红色层，然后转移到另一个1.5mL管中。
添加1.5体积的100%EtOH（即420uL），并通过移液器搅拌。

-----以下是?mirNeasy 的操作步骤-----

将700uL（尽可能多）样品转移到RNeasyMinElute离心柱中，轻轻盖上盖子，然后在8,000G下离心15秒。丢弃流出液。

（*如果需要用于NGS，此时需进行DNase处理。使用RNase-FreeDNaseSet(QIAGEN)。添加350uL?Buffer?RWT⇒8,000G，15分钟
⇒加入DNase反应10分钟
⇒添加350uL?Buffer?RWT⇒8,000G，15分钟
请注意，如果实施此操作，则无需使用700uL?Buffer?RWT进行后续的清洗。)

向离心柱中加入700uL?Buffer?RWT，轻轻盖上盖子，8,000G离心15秒。丢弃流出液。
向离心柱中加入500uL?Buffer?RPE，轻轻盖上盖子，8,000G离心15秒。丢弃流出液。
向离心柱中加入500uL?80%EtOH，慢慢盖上盖子，8,000G离心2分钟。连同流出液一起将收集管丢弃。
将RNeasy?MinElute离心柱放入新的收集管（2mL）。
以最大速度(>12,000G)离心5分钟，同时打开柱盖使其干燥。
将RNeasy?MinElute离心柱放入新的收集管（1.5mL）。向离心柱中加入14uL无RNase水（小容器）（注意不要粘在壁上！避免移液器吸头接触到滤膜！），慢慢盖上盖子，以最大速度(>12,000G)离心1分钟提取RNA。

（*流出液即为样品）

结果示例

EVAGLAX配合清洗液A使用

可得到与超速离心法同等的CD9强度和蛋白质纯度。※

细胞外囊泡miRNA浓度评估

EVAGLAX配合清洗液A使用，可得到与超速离心法同等的总RNA回收量。※

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