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EVAGLAX(TM)细胞外囊泡分离纯化试剂盒使用说明

发布时间:2023-05-09 点击数:570
EVAGLAX?细胞外囊泡分离纯化试剂盒使用说明
EVAGLAX采用了孔径精确可控、并带有抗蛋白质非特异性吸附涂层的多孔玻璃作为过滤膜。无需使用超速离心机即可简便快速地提取来自细胞外囊泡的RNA和蛋白质。同时,离心柱类型易于操作,简化了实验流程,有望减少操作的个体差异,确保实验的重现性。
用途
  • 用于早期诊断和治疗选择的细胞外囊泡衍生生物标志物提取
  • 生物标志物研究、细胞外囊泡基础研究
  • 可用于体液(血清、血浆、尿液等)和细胞培养上清等
特征
  • 孔径精确可控的三维多孔玻璃技术
  • 抗杂质蛋白质非特异性吸附的涂层技术
  • 简便快速地分离细胞外囊泡(15 分钟)
  • 基于尺寸排阻色谱法的原理,可以无偏差地捕获细胞外囊泡
关键技术
  • 多孔玻璃的孔径精确可控,根据尺寸排阻色谱法的原理,可选择性的捕捉细胞外囊泡大小的粒子。
  • 滤膜表面涂有抗杂质蛋白质非特异性吸附的涂层,可抑制白蛋白等杂质蛋白的吸附。
  • 通过与清洗液配合使用,可提高滤膜中捕获的细胞外囊泡的纯度。
 
操作流程
1.预处理
用?0.22 μm 针筒式过滤器预处理样品。
2.细胞外囊泡捕获
将样品?(100-500uL) 注入离心柱中并离心?10 分钟。
3.洗涤
将清洗液注入离心柱中并离心?5 分钟。
4.提取
使用市售的提取试剂从离心柱中提取?RNA 和蛋白质进行分析。
产品组成
商品
20 次检测
100次检测
离心柱
20件
100件
收集管(1.5mL)
20件
100件
洗涤缓冲液A
10mL
50mL
洗涤缓冲液B
10mL
50mL
本试剂盒以外的、需要额外准备的耗材
类别
耗材种类
产品名
厂家
型号
通用
0.2μmPre-filter
Minisart Syringe Filter0.2μm
Sartorius
S6534FMOSK
通用
1mLSyringe
-
-
-
通用
1.5mL low protein adsorption tube
-
-
-
通用
2.0mL low protein adsorption tube
-
-
-
对于RNA
miRNeasy
miRNeasy Micro Kit
QIAGEN
217084
对于蛋白质
M-PER
Mammalian Protein Extraction Reagent
Thermo Fisher Scientific
78501
保存条件
将试剂盒存放在2-10°C的冷藏环境中。
使用目的
本产品仅供研究使用。请不要将本产品用于人类或动物的医学或临床诊断。
细胞外囊泡分离步骤
【样品制备过程】
  • 如果标本已冷冻,请确保在4°C下解冻。
  • 使用?0.2μm滤膜过滤样品
*如果标本粘度高或者含有大量碎屑,建议先进行粗离心10,000G/30 min,然后用?0.2μm滤膜过滤上清液。?粗离心时,建议取上清后留150μL。
【细胞外囊泡捕获过程】
  • 将100-500μL样品添加到离心柱中。
  • 以6,000G离心10分钟。(如果转速不足,追加10,000G/3分钟离心)
*如果担心样品堵塞,请将离心机的温度设置为25°C。
  • 丢弃含有流出液的外管,将内管插入一个新的1.5mL低蛋白吸附的收集管。
(*如果样品中有杂质,可选择追加以下操作:
①样品中的杂质略高的情况
  • 向离心柱中加入100μL洗涤缓冲液A,并以3,000G/5分钟离心。
  • 丢弃含有流出液的外管,将内管插入一个新的2mL低蛋白吸附的收集管。
②样本中的杂质含量高的情况
  • 将300μL洗涤缓冲液B放入离心柱并以3,000G/5分钟离心。
  • 丢弃含有流出液的外管,将内管插入一个新的2mL低蛋白吸附的收集管。
细胞外囊泡裂解步骤
【蛋白质提取工艺】
  • 向离心柱中加入100uL M-PER ,并以500G/1分钟离心。
*请勿丢弃流出液。使用2.0 mL低蛋白吸附的收集管,无需更换。
  • 在室温下保持5分钟?。
  • 以6,000G/5分钟离心。(或者10,000G/3分钟,视情况而定)
  • 收集管中的液体即是样品。
【RNA提取过程】
  • 向离心柱中加入500uLQIAzol并以500G/1分钟离心。
*请勿丢弃流出液。使用2.0mL低蛋白吸附的收集管,无需更换。
  • 在室温下放置5分钟。
  • 以6,000G/5分钟离心。(或者10,000G/3分钟,视情况而定)
  • 将离心得到的液体转移到新的1.5mL低蛋白吸附管中。不需要离心柱。
  • 加入140uL氯仿,涡旋搅拌15秒,室温放置3分钟。
  • 在4°C下以12,000G离心15分钟,样品分成3层。顶部透明层是含有RNA的水层,请吸出280μL透明层,注意避免混入下面的白色和红色层,然后转移到另一个1.5mL管中。
  • 添加1.5体积的100%EtOH(即420uL),并通过移液器搅拌。
-----以下是?mirNeasy 的操作步骤-----
  • 将700uL(尽可能多)样品转移到RNeasyMinElute离心柱中,轻轻盖上盖子,然后在8,000G下离心15秒。丢弃流出液。
(*如果需要用于NGS,此时需进行DNase处理。使用RNase-FreeDNaseSet(QIAGEN)。添加350uL?Buffer?RWT⇒8,000G,15分钟
⇒加入DNase反应10分钟
⇒添加350uL?Buffer?RWT⇒8,000G,15分钟
请注意,如果实施此操作,则无需使用700uL?Buffer?RWT进行后续的清洗。)
  • 向离心柱中加入700uL?Buffer?RWT,轻轻盖上盖子,8,000G离心15秒。丢弃流出液。
  • 向离心柱中加入500uL?Buffer?RPE,轻轻盖上盖子,8,000G离心15秒。丢弃流出液。
  • 向离心柱中加入500uL?80%EtOH,慢慢盖上盖子,8,000G离心2分钟。连同流出液一起将收集管丢弃。
  • 将RNeasy?MinElute离心柱放入新的收集管(2mL)。
  • 以最大速度(>12,000G)离心5分钟,同时打开柱盖使其干燥。
  • 将RNeasy?MinElute离心柱放入新的收集管(1.5mL)。向离心柱中加入14uL无RNase水(小容器)(注意不要粘在壁上!避免移液器吸头接触到滤膜!),慢慢盖上盖子,以最大速度(>12,000G)离心1分钟提取RNA。
(*流出液即为样品)
结果示例
EVAGLAX配合清洗液A使用
可得到与超速离心法同等的CD9强度和蛋白质纯度。※
 
细胞外囊泡miRNA浓度评估
EVAGLAX配合清洗液A使用,可得到与超速离心法同等的总RNA回收量。※