Fluorospark(R) 激酶/ADP 多重检测试剂盒（291-77401）

激酶分析筛选试剂盒
Fluorospark® 激酶/ADP多重检测试剂盒(货号291-77401)
Fluorospark® Kinase/ADP Multi-Assay Kit

Fluorospark® 激酶/ADP多重检测试剂盒

简单快捷，高灵敏度定量检测ADP。用红色荧光“Resorufin”定量经激酶反应生成的ADP，可实时检测。

• 激酶抑制剂的筛选
• 激酶活性测定
• ADP产生酶活性分析

试剂盒原理

本试剂盒通过酶偶联反应，简单、高灵敏度地定量检测ADP。经激酶反应生成的ADP，可用红色荧光物质试卤灵定量。

Fluorospark® 激酶/ADP多重检测试剂盒检测原理

优点/特点

● 适合终点(endpoint)和实时实验
● 优异的Z'-factor数据（数据差异小）
● 高灵敏度检测ADP量
● 检测直到ADP 30 μmol/L仍可保持线性关系
● 一步反应，检测时间短（~30分钟）
● 成本较低

与传统发光法比较

试剂名称	Fluorospark® Kinase	传统发光法（A公司）
原理	ADP定量（荧光） （直接定量生成的ADP）	ADP定量（发光） （需要把生成的ADP变换成ATP再定量）
操作顺序	1步	2步
所需时间	30分钟	70~100分钟
ADP定量范围	~30 μmol/L	~1 mmol/L
价格	低成本

试剂盒组成

No. 试剂	用途	1,000次	10,000次
底物液	2×制备检测液	9 mL	90 mL
酶液		500 μL	5 mL
刃天青液		100 μL	1 mL
还原封闭剂		400 μL	4 mL
D　终止液	停止偶联反应	10 mL	100 mL
10 mmol/L ATP溶液	激酶反应，制作标准曲线	100 μL	1 mL
10 mmol/L ADP溶液	制作标准曲线	100 μL	1 mL

案列应用

激酶反应液里添加等量的2×检测液（使用时制备）即可检测激酶活性

用0、10、20、30 μmol/L ADP制作标准曲线。

良好的线性关系可定量到30 μmol/L的ADP。

制作各ATP/ADP浓度（ATP+ADP=1,10,100 μmol/L）里底物变换率0-10%标准曲线

ATP/ADP标准曲线里底物变换率低（=ADP浓度低）时线性关系依然较好

20 μmol/L ADP和2x检测液混合，在30分钟~7小时候检测荧光强度。30分钟后的荧光强度标准化为全数，相关变动表格如下。

ADP和2×检测液混合后，在30分~7小时内的荧光信号很稳定。

定量与各ATP/ADP浓度（ATP+ADP=1,10,100 μmol/L），5%底物变换率相当的ADP时，本试剂盒方法与传统发光法的Z'-factor比较。

Z'-factor：Fluorospark® Kinase >传统发光法（A公司）
在各ATP浓度里，5%低底物变换率也有优异的Z'-factor。

Z'-facotr是一个关于信号区间和变异的组合，它已成为评估测试方法质量的主要参数。使用Z'-factor=1-(3×SDH+3×SDL)/(AvH-AvL)公式计算（SDH和SDL为阳性对照和阴性对照的方差，AVH和AVL为阳性对照和阴性对照的平均值）。

Z-factor	Interpretation
1.0	理想情况下等于1.0。Z factor永远不可能超过1.0。
0.5-1.0之间	较好的实验。
0-0.5之间	临界的实验（较差的实验）。
小于0	阳性对照和阴性对照的数值有很多重叠。

制作cAMP-依赖性蛋白激酶(PKA)抑制剂H-89的抑制曲线 （PKA 0.02U/μL，ATP 5μmol/L，Kemptide 125μg/mL及各浓度的H-89）

Fluorospark® Kinase与传统发光法（A公司）有几乎相同的IC50值。
（本方法得到的H-89 IC50值与文献值*（IC50=40nmol/L）几乎相同）
* Hidaka, H. et al., Methods Enzymol., 201, 328-39(1991).

通过实时检测荧光强度，实时检测激酶活性。

对各浓度ADP［ADP=0, 0.25, 0.5, 1, 2μmol/L（ATP+ADP=10 μmol/L）］进行实时检测。

Fluorospark® Kinase在约10分钟内完成ADP定量反应。背景（ADP=0 μmol/L）信号稳定。

ADP=2 μmol/L（ATP+ADP=10 μmol/L）里添加还原剂DTT（0.1、1 mmol/L），进行实时检测。

Fluorospark® Kinase在约10分钟内完成ADP定量反应。即使DTT浓度增高，结果依然稳定。

在各种ATP浓度下通过实时检测计算出PKA反应速度，并求取ATP的PKA（Km值）

根据实时检测进行酶的动力学分析。
本方法得到的Km值与文献值**（3~15 μmol/L）几乎相同）
** Flockhart, D.A. and Corbin, J.D., CRC Crit. Rev. Biochem., 12, 133-86(1982).