蛋白质提取中会用到哪些酶类？如何赋能生物药研发与生产
发布时间：2026-11-03 点击数：2
蛋白制备的目的是获取高品质蛋白样品，以尽可能提高下游分析的成功率（例如蛋白质免疫印迹、ELISA、免疫沉淀和质谱分析）。由于蛋白质的结构和功能各不相同，如何平衡提取效率和下游分析中所需蛋白功能的维持是经常面临的挑战。这种权衡对于生物学现象的研究来说至关重要，而实验的成功取决于蛋白样品制备的所选方法和试剂。
从样品中提取靶蛋白是蛋白质分析的第一步，也是决定下游实验数据质量的关键环节。无论采用机械处理还是基于去垢剂的提取方法，都会破坏细胞稳态，导致蛋白降解或不稳定。为了确保蛋白的完整性，避免因变性影响天然蛋白相互作用的检测，选对合适的提取蛋白的方法至关重要，
蛋白质提取方式很多
蛋白质提取方式的选择取决于起始样品的来源，目的蛋白质在细胞内的位置以及下游应用。其他重要考虑因素还包括蛋白质活性和功能的保留，以及背景干扰的降低。
西宝生物可提供种类齐全的优化工具，用于蛋白质的提取和组分分离，并广泛抑制多种蛋白酶和磷酸酶活性。
蛋白质提取方法全解析：动植物与微生物篇
蛋白质是构成生命的基础，它在许多生物过程中都扮演着至关重要的角色。蛋白质提取作为生物科学领域的关键技术，不仅是科学家探索生命奥秘的有力工具，也是推动医学、药物研发以及食品科学等领域发展的重要动力。
植物蛋白质提取
在植物中提取蛋白质，通常采用破碎细胞壁的方法。首先，将植物组织破碎，然后利用不同的溶剂或酶来分离蛋白质。常见的溶剂包括水、盐溶液或有机溶剂。此外，还可以使用离心、过滤等物理方法进一步纯化蛋白质。
动物蛋白质提取
动物蛋白质的提取通常涉及到组织破碎和细胞裂解。例如，从肌肉组织中提取肌蛋白，需要将肌肉组织破碎并使用特定的酶或化学试剂来裂解细胞。之后，通过离心、电泳等手段进一步纯化蛋白质。
微生物蛋白质提取
微生物蛋白质的提取相对简单，通常通过离心收集微生物细胞，然后使用适当的溶剂或酶来裂解细胞。接着，通过离心、过滤等方法进一步纯化蛋白质。
在蛋白质提取中，酶作为重要一环，依靠底物特异性发挥作用：
1.细胞壁降解酶破除微生物、植物的细胞壁屏障，温和释放蛋白；
2.核酸酶降解裂解产生的核酸，降低体系黏度，减少蛋白与核酸的非特异结合；
3.去糖基化酶消除糖链不均一带来的分析障碍；
4.位点特异性蛋白酶用于精准切除重组蛋白标签，获得天然目的蛋白。
虽然部分样本可以依靠去污剂、机械破碎完成提取，但对于活性蛋白、微生物、植物样本和重组蛋白纯化，酶的特异性、温和性是其他方法很难替代的；同时搭配蛋白酶抑制剂抑制内源蛋白酶降解，共同保障目标蛋白完整、稳定。
如何选择合适的酶类产品
第一步：先看样本类型
1.动物细胞 / 软组织（HEK293、Hela、脾脏）
默认：不加裂解酶；RIPA/NP40 去污剂裂解；只加蛋白酶抑制剂
仅当裂解液极黏稠：少量 DNase I + MgCl₂；不要溶菌酶、纤维素酶
糖蛋白电泳不均一：纯化后再加 PNGase F
2.革兰氏阴性菌（E.coli，最常见重组菌）
可选：溶菌酶 + EDTA（EDTA 破外膜，辅助溶菌酶接触肽聚糖）；搭配 DNase I 降黏
备选：超声（很多方案直接超声，不用溶菌酶，避免溶菌酶污染）
3.革兰氏阳性菌
优先溶菌酶，必要延长孵育时间；超声单独裂解效率差
4.酵母（毕赤、酿酒酵母）
优先 Zymolyase（溶壁酶）；或者玻璃珠破碎；溶菌酶对酵母几乎无效
5.植物组织
纤维素酶 + 果胶酶复配，原生质体提取；普通总蛋白也可以直接液氮研磨，不用酶
6.结缔组织、软骨、肿瘤基质丰富样本
明质酸酶、胶原酶，解离基质
第二步：看实验下游目的
l 只做 WB、总蛋白定量：绝大多数情况，只用蛋白酶抑制剂，不需要任何外源酶
l 纯化带标签重组蛋白：纯化后，用 TEV / EK 切除标签（优先 TEV，特异性最好）
糖蛋白，SDS-PAGE 拖尾、分子量不均一：纯化后用 PNGase F
l 后续质谱鉴定：提取完成后，下游制样阶段用胰蛋白酶酶解（不是提取阶段加）
ChIP、Co-IP（要保留蛋白 - 核酸 / 蛋白 - 蛋白相互作用）：严禁 DNase I，会打断核酸，破坏复合物
第三步：权衡破碎方式：酶裂解 VS 机械破碎（超声、珠磨、液氮研磨）
l 酶裂解：温和，适合对剪切敏感的大分子蛋白、多聚体蛋白；缺点：孵育时间长，内源蛋白酶容易降解蛋白，必须控温 + 抑制剂
l 机械破碎：快、便宜；缺点：强剪切力，容易破坏大蛋白、膜蛋白复合物；会产热
酶的分类
1.细胞壁裂解酶
酶 | 底物 / 作用原理 | 适用样本 |
溶菌酶（Lysozyme，rLys-C≠溶菌酶，注意区分！） | 水解肽聚糖β-1,4 糖苷键，破坏革兰氏阳性菌细胞壁；革兰氏阴性菌外膜阻挡，单独溶菌酶效果弱，常配合 EDTA | 大肠杆菌、枯草芽孢杆菌等革兰氏阳性菌；质粒 / 菌体蛋白提取 |
溶壁酶（Lyticase，Zymolyase） | 降解酵母细胞壁 β- 葡聚糖、甘露聚糖；来源于 Arthrobacter，酵母专用 | 酿酒酵母、毕赤酵母（真菌蛋白提取） |
纤维素酶（Cellulase） | 水解纤维素 β-1,4 葡聚糖键，破坏植物细胞壁纤维素骨架 | 植物叶片、愈伤组织 |
果胶酶（Pectinase） | 降解果胶（半乳糖醛酸多聚体），瓦解植物胞间层，解离细胞 | 植物组织，常和纤维素酶复配 |
几丁质酶（Chitinase） | 水解几丁质 β-1,4-N - 乙酰葡糖胺键 | 真菌、昆虫样本 |
注意：这类酶靶向细胞壁多糖 / 肽聚糖，细胞膜保留，释放胞内蛋白；动物细胞不要加，会污染、成本高，动物多用去污剂裂解。
2.核酸降解酶（DNase / RNase，降黏度，减少核酸共沉淀）
DNase I（脱氧核糖核酸酶 I） | RNase A（核糖核酸酶 A） | |
分类： | 内切核酸酶，依赖 Ca2⁺，Mg2⁺；切割 dsDNA、ssDNA，产生 3'-OH、5'-P 寡核苷酸 | RNA 内切酶，切割嘧啶 C/U 的 3'端磷酸二酯键；不依赖金属离子，耐热稳定 |
作用： | 降解基因组 DNA，降低裂解液黏度，减少 DNA - 蛋白复合物 | 降解 RNA，降低黏度，去除 RNA 与蛋白的聚集；质粒制备配套，蛋白提取按需添加 |
适用： | 细菌、动物组织、细胞裂解液；不能用于后续需要保留 DNA 的实验（ChIP） | RNase 非常顽固，极易造成全实验室 RNA 污染，RNA 类实验严禁加！ |
3.蛋白酶(可控酶切、标签切除)
酶 | 类型 | 原理与用途（蛋白提取 / 纯化阶段） |
肠激酶 Enterokinase（EK） | 位点特异性蛋白酶 | 识别序列 DDDDK↓，在赖氨酸后切割；切除 His 标签、MBP 标签；特异性很高，很少非特异切割 |
凝血酶 Thrombin | 丝氨酸蛋白酶 | 识别 LVPR↓GS；常用于 pET 载体凝血酶位点标签切除；缺点：容易非特异切割目标蛋白 |
TEV 蛋白酶（Tobacco Etch Virus protease） | 半胱氨酸蛋白酶 | 识别 ENLYFQ↓G，标签切除酶，特异性好；可带 His 标签，切完后 Ni 柱去除 TEV 自身 |
胰蛋白酶 Trypsin | 丝氨酸内切酶 | 切割 K/R 羧基端；蛋白提取一般不加！ 多用于蛋白胶内酶解、质谱（LC-MS），属于下游鉴定，不是提取 |
胃蛋白酶、木瓜蛋白酶 | 广谱蛋白酶 | 非特异降解；蛋白提取禁止主动添加，仅特殊消化（如抗原制备）才用 |
注意：普通总蛋白提取，绝对不要主动加胰蛋白酶、胃蛋白酶.
4.去糖基化酶（糖蛋白提取专用，去除 N/O 糖链，消除糖基化带来的不均一、电泳拖尾）
酶 | 底物 | 原理 |
PNGase F（肽 N - 糖苷酶 F） | N - 连接糖链 | 切断 Asn 与 N 糖之间酰胺键； 不能切核心 α1-3 岩藻糖修饰的糖（植物 / 昆虫糖蛋白） |
PNGase A | N - 糖 | 可以切带有 α1-3 岩藻糖的 N 糖，适合植物、昆虫糖蛋白 |
O-Glycosidase（O - 糖苷酶） | O - 连接糖链 | 水解丝氨酸 / 苏氨酸上简单 O 糖；对复杂分支 O 糖效率低，常搭配唾液酸酶、半乳糖苷酶 |
唾液酸酶（神经氨酸酶） | 唾液酸（N - 乙酰神经氨酸） | 切除糖链末端唾液酸，暴露下游糖，辅助 O-Glycosidase 工作 |
5.其他酶
透明质酸酶（Hyaluronidase）：降解透明质酸，动物结缔组织、肿瘤组织提取，降低胞外基质黏度，适合皮肤、软骨组织蛋白提取
胶原酶（Collagenase I/II/IV）：降解胶原蛋白，解离致密结缔组织，原代细胞分离配套，蛋白提取少用；胶原酶是混合酶制剂，有蛋白酶杂活性。
这些酶如何赋能生物药研发与生产
在蛋白质提取及下游分析过程中，细胞裂解与稳态破坏往往会引发一系列复杂挑战。针对这一痛点，西宝生物构建了蛋白酶家族产品矩阵， 全面赋能从基础科研的蛋白质提取，到工业级蛋白药物研发生产的全流程。
在样品预处理与提取阶段，细胞裂解后释放的大量核酸会导致料液粘度高，严重阻碍下游纯化。西宝生物的全能核酸酶可广谱降解单链和双链DNA/RNA，快速将高粘度裂解液转化为低粘度流体，从而提高过滤效率和层析柱载量。同时，针对重组蛋白表达中常见的融合标签残留问题，西宝生物提供了几种常用的标签定点切割酶。例如，SUMO蛋白酶能够特异性识别SUMO标签的三维结构并在其C末端切割，在释放目标蛋白的同时不破坏其天然构象；TEV蛋白酶则凭借位点特异性，成为工业化生产中简化下游除杂工艺的常用工具。
在生物制药研发与生产领域，西宝生物的蛋白酶家族更是解决工艺卡脖子问题的有力武器。针对抗体偶联药物（ADC）开发中糖型不均、定点偶联不可控的难题，西宝生物提供IdeS蛋白酶、转谷氨酰胺酶及各类糖苷酶。其中，IdeS蛋白酶可特异性水解抗体铰链区，结合转肽酶介导的有效交联，能够实现抗体与毒素的定点偶联，应用于药物的均一性与安全性研究。此外，针对重组蛋白C端多余的碱性氨基酸，测序级重组羧肽酶B可进行精准修剪，以优化蛋白等电点与活性；而重组胰蛋白酶等则作为基石工具酶，广泛应用于蛋白质组学质谱分析、测序鉴定及翻译后修饰研究。以下为西宝生物蛋白酶家族核心产品清单：
类别 | 西宝编码 | 酶类 | 适用样本 | 核心作用 |
细胞壁裂解酶 | ECE0057F | 溶菌酶（Lysozyme，rLys-C≠溶菌酶，注意区分！） | 大肠杆菌、枯草芽孢杆菌等革兰氏阳性菌；质粒 / 菌体蛋白提取 | 破坏细胞壁、释放蛋白 |
DAA0244A | 溶壁酶（Lyticase，Zymolyase） | 酿酒酵母、毕赤酵母（真菌蛋白提取） | 温和破壁 | |
DCE0400B | 纤维素酶（Cellulase） | 植物叶片、愈伤组织 | 降解细胞壁与胞间层 | |
DCE1564A | 果胶酶（Pectinase） | 植物组织，常和纤维素酶复配 | 降解细胞壁与胞间层 | |
DCE1565A | 几丁质酶（Chitinase） | 真菌、昆虫样本 | 真菌原生质体、昆虫样品前处理 | |
ECE1110A | 蜗牛酶（Snailase） | 酵母/丝状真菌 | 蜗牛消化道复合酶系（纤维素酶、几丁质酶、β-葡糖醛酸酶、硫酸酯酶等），协同降解酵母/真菌细胞壁多糖，制备原生质体 | |
ECE1052B | 胶原酶 Collagenase Type I | 动物组织，肝、肺、脂肪、上皮、肿瘤(通用) | 在 Ca2⁺ 存在下水解天然胶原三螺旋，解离温和、适用组织广 | |
ECE1169B | 胶原酶 Collagenase Type II | 动物组织，胰腺(胰岛)、乳腺、肝、软骨、骨、心 | 中性蛋白酶（酪蛋白酶/梭菌蛋白酶）活性更高，对致密结缔组织与胶原网络消化力强，适合基质丰富的组织 | |
ECE1196B | 胶原酶 Collagenase Type III | 动物组织，乳腺、胎儿组织、膜蛋白敏感样本 | 次级蛋白酶含量最低、选择性高，但保留一定胰蛋白酶活性；对细胞损伤小，适合乳腺等原代细胞分离 | |
ECE1050B | 胶原酶 Collagenase Type IV | 动物组织，胰岛、ADSC、心肌、骨、软骨、肌腱 | 胰蛋白酶活性极低，最大限度保护膜蛋白与受体完整性；适合胰岛原代分离及受体研究 | |
ECE1051B | 胶原酶 Collagenase Type V | 动物组织 | 部分纯化制品，胶原酶与酪蛋白酶活性较高、蛋白水解力强；适合需强消化的结缔组织、胰腺等组织 | |
核酸降解酶 | ECE1160A | 全能核酸酶 | 各类裂解液 | 内切+外切双重活性，非特异降解单/双链 DNA 与 RNA 为 5'-单核苷酸（需 Mg2⁺）；降黏、去除核酸 |
EBY0027A | 蛋白酶K | 特殊前处理 | 广谱丝氨酸蛋白酶，切脂肪族/芳香族氨基酸 C 端肽键；耐 SDS、尿素与高温，灭活核酸酶并降解蛋白 | |
ECE0200B | DNase I（脱氧核糖核酸酶 I） | 细菌、动物组织、细胞裂解液 | Ca2⁺/Mg2⁺ 依赖的内切酶，随机切割单/双链 DNA，产生 3'-OH、5'-P 寡核苷酸；降黏、去 gDNA | |
ECE0201D | RNase A（核糖核酸酶 A） | 蛋白制备物 | 内切核糖核酸酶，专一切割嘧啶（C/U）3'端磷酸二酯键；耐热、不依赖金属离子，降解 RNA | |
标签酶切 | ECE1123A | 肠激酶 Enterokinase（EK） | 重组融合蛋白（N 端 His/GST/MBP/SUMO 标签），需在标签与目的蛋白间引入 DDDDK 位点 | 识别 DDDDK↓，在 Lys 羧基侧切割；特异性去除 N 端标签，切后不残留多余氨基酸 |
ECE0616E | 凝血酶 Thrombin | 含 LVPRGS 位点的融合蛋白（GST/His/MBP）；凝血因子与凝血机制相关研究 | 识别 LVPR↓GS，在 Arg-Gly 间切割；酶切效率高、条件温和，可低温长时间反应 | |
EAE0087B | SUMO 蛋白酶 | 识别SUMO三维结构，实现标签边界切割，保护目标蛋白构象。 | SUMO蛋白酶能够特异性地识别SUMO标签C端的Gly-Gly基序，并在该位点进行精确切割 | |
EBY3644A | TEV 蛋白酶（Tobacco Etch Virus protease） | 含 ENLYFQG 位点的融合蛋白；膜蛋白、结构生物学等敏感样品需 4 ℃ 低温长时酶切 | 识别 ENLYFQ↓G，七肽序列特异性极高、几乎无脱靶；切后仅残留 Gly/Ser | |
DCE0060R | 胰蛋白酶 Trypsin | 贴壁细胞消化传代；蛋白质组学溶液内/胶内酶解；多肽与胰岛素制备 | 丝氨酸蛋白酶，专一切 Lys/Arg 羧基侧肽键（Pro 之前不切）；解离细胞、酶解蛋白 | |
DCE0115N | 胃蛋白酶 | 抗体 F(ab')₂ 片段制备；酸性条件下蛋白水解（胶原、明胶、多肽/食品加工） | 天冬氨酸蛋白酶，最适 pH 1.5-2.5，优先切 Phe/Leu 等疏水残基；酸性条件下自激活 | |
DCE0107A | 木瓜蛋白酶 | IgG 酶切制备 Fab；神经、视网膜等脆弱组织的温和细胞解离；肉类嫩化 | 巯基（Cys）蛋白酶，需 DTT/半胱氨酸＋EDTA 激活；底物谱广，于铰链区上方切 IgG | |
去糖基化酶 | ECE0441H | PNGase F 糖苷酶 | 抗体、融合蛋白、膜蛋白等 N-糖蛋白的糖链释放、糖基化位点与糖型分析 | 水解 N-糖链核心 GlcNAc 与 Asn 间的酰胺键，释放完整 N-聚糖；核心 α1,3-岩藻糖化者有抗性 |
ECE1563A | PNGase A | 植物、昆虫及酵母/丝状真菌表达的重组糖蛋白（含核心 α1,3-岩藻糖） | 杏仁来源，可释放含核心 α1,3-岩藻糖的 N-糖链（PNGase F 抗性部分），以糖肽为底物 | |
DCE0496B-2000ku | O-Glycosidase（O-糖苷酶） | 黏蛋白型 O-糖基化蛋白（mucin、IgA1 铰链区等）；需先用唾液酸酶去唾液酸 | 切除 Ser/Thr 上 Core-1 型（Galβ1-3GalNAc）O-糖链；唾液酸化底物须先经唾液酸酶处理 | |
DCE0457E | 唾液酸酶(α2-3,6,8,9） | 糖蛋白/糖肽、血清糖蛋白、细胞表面糖复合物的去唾液酸化与糖链分析 | 外切酶，水解 α2-3/6/8/9 连接的末端唾液酸，底物谱最广，可完全去唾液酸 | |
DCE0457F | 唾液酸酶(α2-3,6,8） | 糖蛋白、糖脂及细胞表面糖复合物；O-糖链分析前处理 | 水解 α2-3/6/8 连接唾液酸，不作用于 α2,9；用于判别唾液酸连接方式 |