延长半衰期还是引发免疫风暴？藏在糖基化末端的“双子星”——唾液酸

唾液酸，这一位于聚糖非还原末端的带负电荷单糖，在糖蛋白的稳定性与三维构象中扮演着举足轻重的角色。它不仅是分子结构的一部分，更深度参与了众多关键的生物相互作用。例如，免疫球蛋白G（IgG）上N-聚糖的唾液酸化能够增强其抗炎活性；而唾液酸的存在，还能有效防止糖蛋白被肝细胞上的去唾液酸糖蛋白受体吸收，从而显著延长其在血清中的半衰期。

在自然界中，唾液酸以多种形式存在，但在生物制药领域，N-聚糖和O-聚糖上的两种主要类型是N-乙酰神经氨酸（Neu5Ac）和N-羟乙酰神经氨酸（Neu5Gc）。人体无法合成Neu5Gc，因此含有Neu5Gc的药物可能引发免疫反应。部分患者体内存在高水平的抗NeuGc抗体，这可能导致含有NeuGc的生物药品被中和及快速清除。值得注意的是，细胞系的选择会极大影响生物制药中唾液酸的类型，例如小鼠IgG上的唾液酸多以Neu5Gc为主。

因此，为了确保生物药品的安全性与有效性，在其产品生命周期的所有阶段，以及批次间质量控制中，对唾液酸的水平与类型进行检测至关重要。这已不仅仅是科研追求，更是ICH Q6B指导原则中对生物药物表征所提出的明确监管要求。正因如此，唾液酸（NeuAc）和神经氨酸（NeuGc）的分析被视为生物治疗药物的关键质量属性（CQA）。面对这一关键需求，Ludger提供了专业且完备的解决方案。

LudgerTag™ DMB唾液酸释放标记试剂盒（货号：LT-KDMB-A1）整合了从糖蛋白中释放唾液酸并进行DMB荧光标记的所有必需组分。其核心原理是：首先通过温和的酸水解（在80°C下使用2M醋酸孵育2小时）从糖蛋白上释放唾液酸；随后，利用1,2-二氨基-4,5-亚甲氧基苯（DMB）对释放的唾液酸进行荧光标记。当唾液酸开环时，会暴露羧基旁的酮基，DMB与之连接生成荧光产物，这一反应对唾液酸具有高度特异性。试剂盒的配置充分考虑了定量的准确性与便捷性。

它包含了可检测多达22个糖蛋白样品（每样品含50-100 μg糖蛋白）的试剂与材料，每个标记反应可处理约10 pmol至2.5 nmol的唾液酸。试剂盒内附有唾液酸参考标准品（含Neu5Ac、Neu5Gc、Neu5,7Ac₂、Neu5,Gc9Ac、Neu5,9Ac₂及Neu5,7,(8),9Ac₃Gc），以及NeuAc和NeuGc的定量标准品。通过制备定量标准品的系列稀释液，即可建立标准曲线，实现精准的绝对定量分析。

释放过程对照质控

样品缓冲液或水作为阴性对照；

胎球糖蛋白（GCP-FET-50U）和/或定量的糖肽（BQ-GPEP-A2G2S2-10U）作为阳性对照。

完成标记后，样品可通过高效液相色谱（HPLC）或超高效液相色谱（UHPLC）进行分析。Ludger提供了专用的色谱柱，如LudgerSep R1 HPLC色谱柱（LS-R1-4.6x150）和LudgerSep UR2 UHPLC色谱柱（LS-UR2-2.1x100）。其中，UR2 UHPLC色谱柱配合优化的方法，能够实现更快的运行时间。唾液酸参考标准品也可作为系统适用性标准品，在样品运行前用于检查色谱柱对聚糖的分离效果。唾液酸参照品（CM-SRP-01）和 Neu5,9Ac2被用于唾液酸鉴定。下方图1和图2分别是唾液酸参照品（CM-SRP-01）在LudgerSep R1 HPLC色谱柱和LudgerSep UR2 UHPLC色谱柱上跑的典型图谱。（注：此色谱图仅供参考。峰宽、分辨率和保留时间取决于您实验室中超高效液相色谱（UHPLC）系统的设置）

峰：1 = Neu5Gc；2 = Neu5Ac；3 = Neu5,7Ac 2 ；4 = Neu5Gc,9Ac；5 = Neu5,8Ac 2 ；6 = Neu5,9Ac 2 ；7 = Neu 5,x ,xAc 3 （其中 x 为未知乙酰基位置）；* = 试剂。、

峰：1 = Neu5Gc；2 = Neu5Ac；3 = Neu5,7Ac 2 ；4 = Neu5Gc,9Ac；5 = Neu5,8Ac 2 ；6 = Neu5,9Ac 2 ；7 =Neu 5,x ,xAc 3 （其中 x 为未知乙酰基位置）；* = 试剂。

参照标准曲线测定nmol/mg蛋白中Neu5Gc、Neu5Ac的含量

Neu5Gc、Neu5Ac、Neu5,9Ac2的相对比例按%峰面积计算

西宝生物科技（上海）股份有限公司是Ludger的中国区总代理，提供唾液酸分析产品与方案，咨询/订购热线： 400-021-8158