如何破解细胞培养中支原体污染难题

支原体（Mycoplasma）污染是细胞培养领域最为棘手的难题之一。这类直径仅0.1-0.3μm的生物体，能轻松穿透常规滤膜，却能在污染后长期与细胞共存而不引起培养基浑浊，因而导致实验数据失真。据统计，全球细胞系支原体污染率高达15%-60%，而国内传代细胞的污染率甚至超过57%，其所带来的危害主要有以下几个方面：

1、实验数据失真：支原体会抑制细胞生长、改变膜抗原性，甚至导致染色体畸变，使药物筛选、基因编辑等研究结果不可靠。

2、资源浪费：污染发生后，需耗费数周重新培养细胞，延误科研进度。单是一支被污染的干细胞系可能直接导致数十万元损失。

3、生物安全风险：人源性支原体（如口腔支原体）可能通过气溶胶传播，威胁实验人员健康。

图：细胞和基因治疗产品支原体分析的药典检测要求^【1】

图： 不同稀释浓度支原体对BHK21细胞培养的影响（A: 阴性对照; B ~ I: 10^-1, 10^-2, 10^-3, 10^-4, 10^-5, 10^-6, 10^-7, 10^-8）^【2】

针对支原体污染，西宝生物支原体清除试剂提供了一种高效解决方案。该试剂包含两类主要药物：一种可抑制支原体蛋白质合成，另一种可阻断支原体DNA合成。通过连续7~14d处理，该试剂能够彻底杀灭并清除支原体，其效果持久可靠，应用过程如下：

1、试剂保存与稀释

将支原体清除试剂分装成小规格，置于4℃冰箱保存。如短期内未使用，剩余试剂需存放于-20℃冷冻以保持效力。使用时，按照1:100的体积比例，将试剂加入到完全培养基中。

2、细胞培养准备

以T25细胞培养瓶为例，接种50-100万个细胞，加入4-6mL含支原体清除试剂的全新完全培养基。

3、培养基更换与细胞传代

每2-3天更换一次含支原体清除试剂的全新完全培养基。进行细胞传代时，需先离心，取适量细胞转移到新的T25细胞培养瓶中，并添加含支原体清除试剂的新鲜完全培养基。

4、支原体检测与处理周期

经过7-10天处理后，使用支原体检测试剂盒检测支原体清除情况，如仍有残留，可继续处理1-2个周期后再检测。为确保彻底清除支原体，建议在1个月后进行复检，以排除潜在的污染风险。

经实验室全方位测试验证，该清除试剂对包括293T、HeLa、CHO-K1、LX2、SP2/0、ST、Vero、HA-VSMC、Jurkat及Min-6等在内的多种细胞系均表现出显著的支原体清除效果。同时，试剂对细胞的正常生理功能未产生明显负面影响，未观察到显著毒副作用，确保细胞培养的安全性与稳定性。

【1】Totten AH, Adams AJ, Halas HK, Gebo JET, East AD, Lau AF. Comparison of Five Commercial Molecular Assays for Mycoplasma Testing of Cellular Therapy Products. J Clin Microbiol. 2023 Feb 22;61(2):e0149822. doi: 10.1128/jcm.01498-22.

【2】Netto C, Soccol VT, Sepulveda LM, Timenetsky J. Experimental infection of BHK21 and Vero cell lines with different Mycoplasma spp. Braz J Microbiol. 2015 Mar 4;45(4):1513-9. doi: 10.1590/s1517-83822014000400048.