细胞活力检测：为细胞增殖与毒性研究赋能
发布时间：2024-11-19 点击数：3
细胞活力测试是评估细胞在特定条件下存活能力的重要手段，广泛应用于药物筛选、生物医学研究等领域。根据不同的测试需求和细胞类型，存在多种细胞活力测试方法及其相应的试剂。MTT法和LDH法适用于初步评估细胞毒性或活力，而WST-8法和ATP测定法则更适合于高通量筛选和快速评估。
细胞活力检测的常见方法
一、 MTT法
MTT（3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四氮唑溴化物）是一种广泛用于细胞活力和细胞毒性研究的测定方法。该方法基于活细胞线粒体中的脱氢酶活性，能够将MTT还原为紫色的甲唑蓝，通过测量其吸光度来评估细胞的代谢活性和存活率。
操作步骤：
首先将MTT溶液加入培养板中，经过一定时间培养后，加入二甲基亚砜（DMSO）溶解甲臜，然后使用酶标仪在570 nm波长处测定吸光度。
准确性:
1.敏感性和特异性：MTT法被认为是一种敏感且快速的方法，适用于多种细胞类型和条件下的细胞活力测定。例如，在比较不同方法评估哺乳动物细胞培养物的活力时，MTT法显示出较高的灵敏度。
2.定量能力：MTT法能够提供精确的定量结果，这对于研究细胞增殖和细胞毒性具有重要意义。
局限性:
1.干扰因素：MTT法可能受到多种因素的干扰，如细胞培养基的组成、细胞释放的内含物（如细胞裂解液和分泌物）、以及外部添加物（如金纳米粒子）等。这些因素可能影响MTT的还原和结果的解释。
2.与其他检测方法的不一致性：在某些情况下，MTT法的结果与其他更敏感或无干扰的方法（如ATP测定法）不一致。这表明在使用MTT法时需要谨慎，并考虑采用其他验证方法。
3.对特定药物或化合物的反应性：在某些特定的药物或化合物存在下，MTT法可能无法准确反映细胞的实际存活情况。例如，与多柔比星（DOX）和氟苯尼酮（FPh）共培养时，MTT法未能正确反映细胞存活率。
二、 WST-8法
这是一种基于细胞代谢活性的比色法，通过测定WST-8试剂在活细胞中被还原产生的黄色产物的吸光度来评估细胞活力。这种方法适用于快速、简便的细胞活力检测。
CCK-8 细胞活力检测的基本原理及综述
操作步骤：
直接将WST-8溶液加入培养板中，无需额外处理即可进行检测。使用酶标仪在450 nm波长处测定吸光度，从而反映活细胞数量。
三、 LDH法
乳酸脱氢酶（LDH）是一种胞浆酶，当细胞膜完整性受损时会释放到培养基中。通过测定培养基中的LDH活性，可以间接评估细胞的存活状态。具体步骤包括：
1、将细胞裂解，释放LDH；
2、LDH催化乳酸氧化生成NADH，NADH与INT反应生成甲臜；
3、甲臜的量与LDH活性成正比，通过比色法检测吸光度来定量LDH活性。
与其他细胞活力测试方法相比，LDH法具有一定的优势和局限性。例如，与MTT法相比，LDH法在某些情况下显示出更高的灵敏度和更低的背景噪音比。而在评估热效应对细胞活力的影响时，LDH法的灵敏度低于晶体紫染色法。
四、 ATP测定法
ATP（三磷酸腺苷）是细胞能量的直接来源，其浓度的变化可以反映细胞的活力和增殖状态。ATP测定法通常基于生物发光反应，即ATP与荧光素酶（一种从萤火虫腹部提取的酶）反应产生荧光。具体步骤包括：
1、使用裂解液裂解细胞以释放ATP;
2、在荧光素酶存在下，ATP与荧光素反应生成荧光;
3、发光强度与ATP浓度成正比，通过测量发光强度来评估细胞的活力和增殖情况。
在高通量筛选中，ATP测定法主要通过生物发光分析、基于纳米粒子的检测策略、以及基于核酸的传感技术等方式进行。
五、LUCS法
这是一种基于化学发光测定ATP含量，通过测定细胞内ATP水平来反映细胞活性。ATP是细胞代谢的重要能量来源，其含量与细胞增殖和存活密切相关。
操作步骤：
将LUCS试剂加入培养板中，经过一定时间孵育后，使用化学发光检测仪测定发光强度，从而评估细胞活性。
实验流程
实验结果1
比较新鲜的牙周膜干细胞（PDLSCs）和冷冻保存后的牙周膜干细胞（cPDLSCs）的增殖率
实验结果2
miR-34a对SRA01/04人类晶状体上皮细胞增殖和凋亡的影响
方法 | 西宝产品 | 说明 |
MTT法 | MTT（3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑溴化物） | 用于细胞增殖和细胞毒性检测 |
二甲基亚砜（DMSO） | 常用的有机溶剂，用于溶解不溶于水的化合物 | |
含有10%胎牛血清的Dulbecco's modified Eagle's medium（DMEM）培养基 | 哺乳动物细胞培养的合成培养基 | |
LDH法 | 磷酸盐缓冲液（Phosphate Buffer Solution, PBS） | 用于维持反应体系的pH值，通常为0.10 M磷酸盐缓冲液，pH值约为6.5 |
NADH | 作为LDH催化反应中的底物之一 | |
丙酮酸（Pyruvate） | LDH催化反应中的底物之一 | |
四唑盐（INT） | NADH可以将四唑盐还原成红色的水溶性甲臜（formazan），通过测量492 nm处的吸光度来定量LDH的活性 | |
酚试剂（Phenazine methosulfate, PMS） | 作为催化剂，帮助NADH还原四唑盐 | |
Triton X-100或其他裂解剂 | 用于裂解细胞，释放LDH到细胞培养基中 | |
胎牛血清（Fetal Bovine Serum, FBS） | 添加一定浓度的FBS来维持细胞活性 | |
WST-8法 | WST-8 （cck-8原料） | 还原生成的产物是水溶性的，不需要后续的DMSO溶解 |
ATP测定法 | PBS (磷酸盐缓冲液) | 用于洗涤细胞 |
GNRs-710 和 GNR-860 (两种金纳米棒) | 用于细胞标记 | |
ATP reagent | 用于生物发光测定 | |
培养基系列 |
* 部分内容来自网络及论文
参考文献：
1. Wu Xiang, et al. miR‑34a suppresses proliferation and induces apoptosis of human lens epithelial cells by targeting E2F3. Mol Med Rep 2016 Dec;14(6):5049-5056
2. Mengying Li, et al. Effect of cryopreservation on proliferation and differentiation of periodontal ligament stem cell sheets.Stem Cell Research & Therapy volume 8, Article number: 77 (2017)